本應用說(shuō)明是在µ-Slide ibiPore SiN載玻片內創(chuàng )建單層人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的方案。在涂層和細胞接種后，使用ibidi pump system泵系統/流體剪切力系統將內皮單層暴露于單向層流剪切應力下。該方案的重點(diǎn)是將µ-Slide ibiPore SiN與使用ibidi pump system泵系統施加剪切應力相結合。

　　ibidi用于研究動(dòng)態(tài)或靜態(tài)條件下遷移和傳輸的解決方案：

　　• µ-Slide ibiPore SiN

　　• ibidi Pump System

　　相關(guān)文件：

　　•Instructions µ-Slide ibiPore SiN

　　•Instructions ibidi Pump System

　　1、材料

　　•µ-Slide ibiPore SiN 0.5μm/20% ibiTreat (貨號：85216-S,ibidi,德國)

　　•ibidi Pump System泵系統 (貨號：10902.ibidi,德國)

　　•灌流管套裝紅色，15cm,內徑1.6mm (貨號：10962.ibidi,德國)

　　•螺旋式管道夾 (貨號：10861.ibidi,德國)

　　•人臍靜脈內皮細胞，HUVEC,(貨號：C-12203.PromoCell,德國)

　　•內皮細胞生長(cháng)培養基(貨號：C-22010.PromoCell,德國),輔以?xún)绕ぜ毎L(cháng)培養基補充混合液(貨號：C-39215.PromoCell,德國)

　　•Accutase細胞解離液(貨號：A1110501.Gibco)

　　•IV型膠原蛋白(貨號：354233.Corning)

　　•標準細胞培養設備(無(wú)菌工作臺、細胞培養箱、培養瓶、PBS等)

　　重要提示：在實(shí)驗前一天，將所有所需材料(如 µ-Slides 載玻片、培養基和灌流管(套裝)在37°C和5%CO2的培養箱中平衡過(guò)夜，這對防止氣泡隨時(shí)間產(chǎn)生至關(guān)重要。

　　2、包被載玻片

　　•按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，將IV型膠原蛋白涂層溶液稀釋至40µg/mL的最終濃度

　　•在 µ-Slide 載玻片上涂上一層涂層 (詳細的涂層方案見(jiàn) µ-Slide ibiPore SiN 使用說(shuō)明)

　　•吸干涂層溶液

　　•用PBS沖洗兩次

　　•在室溫下晾干 µ-Slide 載玻片，然后再接種細胞

　　3、制備及接種細胞

　　•在添加了混合補充劑的內皮細胞生長(cháng)培養基中培養HUVEC

　　•用 Accutase 細胞解離液處理細胞2分鐘，使其分離

　　•收集細胞懸液

　　•離心細胞懸浮液，用生長(cháng)培養基稀釋以獲得所需的濃度

　　•計數細胞，調整至2x106 cells/ml的濃度，使細胞貼壁后的光學(xué)匯合度達到100%

　　• 將細胞接種到 μ-Slide ibiPore SiN 的下部通道中(細胞播種的詳細說(shuō)明請參閱μ-Slide ibiPore SiN使用說(shuō)明)。

　　•在37°C和5%CO2條件下培養兩小時(shí)，讓細胞貼壁。

　　重要提示：用于繁殖的培養的內皮細胞不應生長(cháng)到接近100%的光融合。融合的單層進(jìn)入生長(cháng)抑制狀態(tài)，這會(huì )阻止細胞增殖并改變細胞的生理機能。只有在需要單層培養的實(shí)驗中，才建議采用100%匯合。

　　4、灌注

　　•在相差顯微鏡下控制細胞貼壁的程度

　　•為清除 ibidi Pump System 泵系統中的氣泡，在連接 μ-Slide ibiPore SiN載玻片前，先讓其運行1-2小時(shí)

　　重要提示：實(shí)驗當天如何清除系統中的氣泡，請參閱ibidi Pump System泵系統使用說(shuō)明

　　•用 ibidi 螺旋式管道夾或霍夫曼管道夾夾住灌流管的管道

　　•將 µ-Slide ibiPore SiN載玻片連接到管道上

　　•緩慢打開(kāi)夾緊的管道，以盡量減小壓力峰值

　　•按照下表中的參數開(kāi)始灌注實(shí)驗。開(kāi)始時(shí)低流量是使細胞適應剪切應力的必要條件

　　5、結果

　　人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在 ibidi μ-Slide ibiPore SiN 0.5μm 載玻片中以 10dyne/cm2流體剪切力條件下培養(A)和靜態(tài)條件下(B)培養24小時(shí)，窗口大小2mm×2mm，4倍物鏡，相差，比例尺200µm